[et_pb_section fb_built=”1″ _builder_version=”4.21.0″ _module_preset=”default” use_background_color_gradient=”on” background_color_gradient_direction=”140deg” background_color_gradient_stops=”#004872 0%|rgba(41,17,96,0.49) 100%” background_color_gradient_overlays_image=”on” background_color_gradient_start=”#004872″ background_color_gradient_end=”rgba(41,17,96,0.8)” background_image=”https:\/\/www.itim-cj.ro\/PNCDI\/mebpepepr\/wp-content\/uploads\/2023\/06\/cmArtboard-1.jpg” min_height=”325px” min_height_tablet=”325px” min_height_phone=”270px” min_height_last_edited=”on|phone” global_colors_info=”{}”][et_pb_row _builder_version=”4.16″ _module_preset=”default” custom_padding=”60px|||||” global_colors_info=”{}”][et_pb_column type=”4_4″ _builder_version=”4.16″ _module_preset=”default” global_colors_info=”{}”][et_pb_text _builder_version=”4.23.4″ _module_preset=”default” header_font=”Roboto|500|||||||” header_text_color=”#FFFFFF” header_font_size=”44px” global_colors_info=”{}”]<\/p>\n
[\/et_pb_text][\/et_pb_column][\/et_pb_row][\/et_pb_section][et_pb_section fb_built=”1″ _builder_version=”4.16″ _module_preset=”default” global_colors_info=”{}”][et_pb_row _builder_version=”4.16″ _module_preset=”default” global_colors_info=”{}”][et_pb_column type=”4_4″ _builder_version=”4.16″ _module_preset=”default” global_colors_info=”{}”][et_pb_text _builder_version=”4.24.3″ _module_preset=”default” hover_enabled=”0″ custom_css_before=”||||” global_colors_info=”{}” sticky_enabled=”0″]<\/p>\n
A1.1: Proiectarea \u0219i clonarea MeBP bogat \u00een Cys<\/strong>, A1.2:<\/strong> Proiectarea \u0219i clonarea MeBP bogat \u00een His, A1.3: Generarea de constructe bogate \u00een aminoacizi carboxila\u021bi <\/strong><\/p>\n Au fost proiecta\u021bi primeri pentru introducerea MeBPep bogat\u0103 \u00een Cys, His \u0219i aminoacizi carboxila\u021bi \u00een celule. Ulterior myrGFP-MeBPep-(Cys\/His\/aminoacizi carboxila\u021bi – rich) a fost amplificat prin PCR. Ampliconilor ob\u021binu\u021bi \u00een vectorul pGREG596, care datorit\u0103 secven\u021bei de miristoilare la cap\u0103tul N-terminal al ADN-uli pentru GFP permite exprimarea pe fa\u021ba interioar\u0103 a membranei plasmatice, au fost clona\u021bi. Ampliconii purifica\u021bi au fost inclu\u0219i \u00een vectorul pCRII prin procedeul TA cloning pentru subclon\u0103ri ulterioare \u00een vectori de interes. \u00cen paralel, ampliconii purifica\u021bi au fost cliva\u021bi cu restrictazele Spe<\/em>I \u0219i Sal<\/em>I \u0219i introdu\u0219i \u00een pGREG595 (\u00eentre situsurile Spe<\/em>I \u0219i Sal<\/em>I, concomitent cu eliminarea fragmentului myGFP din vector. Prin acest procedeu se \u00eenlocuie\u0219te fragmentul myrGFP cu myrGFP-MeBSeq. Saccharomycs cerevisiae <\/em>BY4741 a fost transformat cu constructele ob\u021binute, ob\u021bin\u00e2ndu-se transforman\u021bi pentru toate plasmidele pozitive.<\/p>\n A1.4: Identificarea unor condi\u021bii adecvate pentru prepararea culturilor de <\/strong>drojdie pentru spectroscopie EPR.<\/strong><\/p>\n Tamponului de suspensie celular\u0103 a fost optimizat pentru cele 4 linii celulare, WT, <\/em>PMR1, <\/em>\u00a0<\/em>SMF1 <\/em>\u0219i PH84<\/em> \u0219i teste pentru stadiul optim de cre\u0219tere au fost efectuate prin analizarea popula\u021biilor de celule prin spectroscopiea UV-Vis la 400 nm pentru a determina densitatea optic\u0103 (DO) care indic\u0103 gradul de cre\u0219tere. Prin aceea\u0219i metoda densit\u0103\u021bii celulare optima \u00eentr-o popula\u021bie a fost determinat\u0103.<\/p>\n A1.5:\u00a0 Cultura celular\u0103 a tulpinilor de drojdie care exprim\u0103 diverse<\/strong> GFP-MeBPep \u00een medii sintetice care imit\u0103 mediile obi\u0219nuite, care con\u021bin concentra\u021bii sc\u0103zute, dar definite de metale esen\u021biale. Caracterizare prin spectroscopia EPR. <\/strong><\/p>\n Culturile de culele WT, <\/em>PMR1, <\/em>\u00a0<\/em>SMF1 si PH84<\/em> au fost incubate in prezenta metalelor esen\u021biale, in acest caz ioni de Mn2+<\/sup>, variind timpul de expunere si concentra\u021bia metalelor. M\u0103sur\u0103torile efectuate prin microscopia electronica prin transmisie (TEM) \u00eempreuna cu EDS si mapping arata ca ionii de Mn2+<\/sup> rama\u0219i sunt lega\u021bi \/ acumula\u021bi in celule, fiind elimina\u021bi cei nelega\u021bi rama\u0219i in suspensie.<\/p>\n Pentru a determina condi\u021biile optime de cre\u0219tere a linilor celulare folosite in prezenta ionilor de Mn2+<\/sup> pentru a fi analizate prin metoda spectroscopica EPR concentra\u021bia de Mn si timpii de incubare au fost varia\u021bi. Au fost analizate diferite concentra\u021bii de Mn la diferiti timpi de incubare. Timpii de incubare de 30 si 60 de minute si concentrati de Mn sub 1 mM s-au dovedit a cele mai favorabile pt spectroscopia EPR.<\/p>\n A1.6: Cultura celular\u0103 a tulpinilor de drojdie care exprim\u0103 diverse<\/strong> GFP-MeBPep \u00een medii sintetice care con\u021bin concentra\u021bii mai mari dec\u00e2t cele normale, dar definite de metale esen\u021biale. Caracterizare prin spectroscopia EPR<\/strong><\/p>\n Pentru a testa capacitatea linilor celulare folosite WT, PMR1,\u00a0 SMF1 si PH84, concentra\u021bia de ioni de Mn2+<\/sup> a fost variata de la 0 la 2 mM la un timp de incubare de 30 si 60 de minute. Semnalul EPR a celor 4 linii celulare in prezenta ionilor de Mn cu o concentra\u021bie mai mica sau egala cu 1 mM prezinta intensitati similara, indic\u00e2nd un mecanism al celulelor de blocare a metalelor. La concentra\u021bia de 2 mM Mn semnalul EPR creste puternic in cazul tuturor linilor celulare, indic\u00e2nd o hiperacumulare a ionilor de Mn la nivelul celulelor.<\/p>\n Act 2.1 – Proiectarea \u0219i clonarea MeBP bogat \u00een Cys, Act 2.2 – Proiectarea \u0219i clonarea MeBP bogat \u00een His (din O1, parea 2)<\/strong><\/p>\n Au fost proiectati primeri pentru introducerea MeBPep bogat\u0103 \u00een Cys si His in celule. Ulterior myrGFP-MeBPep-(Cys\/His\/aminoacizi carboxila\u021bi – rich) a fost amplificat prin PCR. Ampliconilor ob\u021binu\u021bi \u00een vectorul pGREG596, care datorit\u0103 secven\u021bei de miristoilare la cap\u0103tul N-terminal al ADN-uli pentru GFP permite exprimarea pe fa\u021ba interioar\u0103 a membranei plasmatice, au fost clonati. Ampliconii purifica\u021bi au fost inclu\u0219i \u00een vectorul pCRII prin procedeul TA cloning pentru subclon\u0103ri ulterioare \u00een vectori de interes. \u00cen parelel, ampliconii purifica\u021bi au fost cliva\u021bi cu restrictazele Spe<\/em>I \u0219i Sal<\/em>I \u0219i introdu\u0219i \u00een pGREG595 (\u00eentre situsurile Spe<\/em>I \u0219i Sal<\/em>I, concomitent cu eliminarea fragmentului myGFP din vector. Prin acest procedeu se \u00eenlocuie\u0219te fragmentul myrGFP cu myrGFP-MeBSeq. Saccharomycs cerevisiae <\/em>BY4741 a fost transformat cu constructele ob\u021binute, ob\u021binandu-se transforman\u021bi pentru toate plasmidele pozitive.<\/p>\n Act 2.3 – Cultura celular\u0103 a tulpinilor de drojdie care exprim\u0103 diverse GFP-MeBPep \u00een medii sintetice care imit\u0103 mediile obi\u0219nuite, care con\u021bin concentra\u021bii sc\u0103zute, dar definite de metale esen\u021biale. Caracterizare prin spectroscopia EPR. (din O2, partea 2), Act 2.4 – Cultura celular\u0103 a tulpinilor de drojdie care exprim\u0103 diverse GFP-MeBPep \u00een medii sintetice care con\u021bin concentra\u021bii mai mari dec\u00e2t cele normale, dar definite de metale esen\u021biale. Caracterizare prin spectroscopia EPR (din O3, partea 2)<\/strong><\/p>\n Culturile de culele By212 0, 4, 5, 22 si DE3, E9, D9, H9 au fost incubate in prezenta metalelor esen\u021biale, in acest caz ioni de Cu2+<\/sup> si Mn2+<\/sup> variind timpul de expunere si concentra\u021bia.<\/p>\n Pentru a determina condi\u021biile optime de cre\u0219tere a linilor celulare folosite in prezenta ionilor de Cu2+<\/sup> si\/sau Mn2+<\/sup> pentru a fi analizate prin metoda spectroscopica EPR concentra\u021bia de ioni demetale si timpii de incubare au fost varia\u021bi. Au fost analizate diferite concentra\u021bii de Cu si\/sau Mn la diferiti timpi de incubare. Timpii de incubare de 30 de minute si concentrati de Cu sub 1 mM s-au dovedit a cele mai favorabile pt spectroscopia EPR. In cazul ionilor de Mn nu a putut fi stabilita o limita superioara a concentratie de Mn asimilata de celule ei nefiind toxici, ca si cei de Cu, pt linile celulare folosite.<\/p>\n \u00a0<\/strong>Act 2.5 – Dezvoltarea unui script MATLAB folosind rutina EasySpin pentru a simula spectrele EPR ob\u021binute (din O4, partea 1)<\/strong><\/p>\n A fost dezvoltat un script Matlab pt simularea spectrelor EPR a ionilor de Cu2+<\/sup> si Mn2+<\/sup> pentru toate liniile celulare propuse. Prin simularea spectrelor EPR s-au putut determina cu o mai mare exactitate parametrii EPR a ionilor de metale folositi si mobilitatea acestora, stabilindu-se ca ei au fost incorporati in celule.<\/p>\n Report Stage 1<\/strong><\/a><\/p>\n Report Stage 2<\/strong><\/a><\/p>\n Final Scientific Report<\/a><\/strong><\/p>\nEtapa 2<\/strong><\/h3>\n
Activity reports
<\/strong><\/h2>\nPublications<\/strong><\/h2>\n