Results
Rezumat executiv al activităților realizate în perioada de implementare
Etapa 1
A1.1: Proiectarea și clonarea MeBP bogat în Cys, A1.2: Proiectarea și clonarea MeBP bogat în His, A1.3: Generarea de constructe bogate în aminoacizi carboxilați
Au fost proiectați primeri pentru introducerea MeBPep bogată în Cys, His și aminoacizi carboxilați în celule. Ulterior myrGFP-MeBPep-(Cys/His/aminoacizi carboxilați – rich) a fost amplificat prin PCR. Ampliconilor obținuți în vectorul pGREG596, care datorită secvenței de miristoilare la capătul N-terminal al ADN-uli pentru GFP permite exprimarea pe fața interioară a membranei plasmatice, au fost clonați. Ampliconii purificați au fost incluși în vectorul pCRII prin procedeul TA cloning pentru subclonări ulterioare în vectori de interes. În paralel, ampliconii purificați au fost clivați cu restrictazele SpeI și SalI și introduși în pGREG595 (între situsurile SpeI și SalI, concomitent cu eliminarea fragmentului myGFP din vector. Prin acest procedeu se înlocuiește fragmentul myrGFP cu myrGFP-MeBSeq. Saccharomycs cerevisiae BY4741 a fost transformat cu constructele obținute, obținându-se transformanți pentru toate plasmidele pozitive.
A1.4: Identificarea unor condiții adecvate pentru prepararea culturilor de drojdie pentru spectroscopie EPR.
Tamponului de suspensie celulară a fost optimizat pentru cele 4 linii celulare, WT, PMR1, SMF1 și PH84 și teste pentru stadiul optim de creștere au fost efectuate prin analizarea populațiilor de celule prin spectroscopiea UV-Vis la 400 nm pentru a determina densitatea optică (DO) care indică gradul de creștere. Prin aceeași metoda densității celulare optima într-o populație a fost determinată.
A1.5: Cultura celulară a tulpinilor de drojdie care exprimă diverse GFP-MeBPep în medii sintetice care imită mediile obișnuite, care conțin concentrații scăzute, dar definite de metale esențiale. Caracterizare prin spectroscopia EPR.
Culturile de culele WT, PMR1, SMF1 si PH84 au fost incubate in prezenta metalelor esențiale, in acest caz ioni de Mn2+, variind timpul de expunere si concentrația metalelor. Măsurătorile efectuate prin microscopia electronica prin transmisie (TEM) împreuna cu EDS si mapping arata ca ionii de Mn2+ ramași sunt legați / acumulați in celule, fiind eliminați cei nelegați ramași in suspensie.
Pentru a determina condițiile optime de creștere a linilor celulare folosite in prezenta ionilor de Mn2+ pentru a fi analizate prin metoda spectroscopica EPR concentrația de Mn si timpii de incubare au fost variați. Au fost analizate diferite concentrații de Mn la diferiti timpi de incubare. Timpii de incubare de 30 si 60 de minute si concentrati de Mn sub 1 mM s-au dovedit a cele mai favorabile pt spectroscopia EPR.
A1.6: Cultura celulară a tulpinilor de drojdie care exprimă diverse GFP-MeBPep în medii sintetice care conțin concentrații mai mari decât cele normale, dar definite de metale esențiale. Caracterizare prin spectroscopia EPR
Pentru a testa capacitatea linilor celulare folosite WT, PMR1, SMF1 si PH84, concentrația de ioni de Mn2+ a fost variata de la 0 la 2 mM la un timp de incubare de 30 si 60 de minute. Semnalul EPR a celor 4 linii celulare in prezenta ionilor de Mn cu o concentrație mai mica sau egala cu 1 mM prezinta intensitati similara, indicând un mecanism al celulelor de blocare a metalelor. La concentrația de 2 mM Mn semnalul EPR creste puternic in cazul tuturor linilor celulare, indicând o hiperacumulare a ionilor de Mn la nivelul celulelor.
Etapa 2
Act 2.1 – Proiectarea și clonarea MeBP bogat în Cys, Act 2.2 – Proiectarea și clonarea MeBP bogat în His (din O1, parea 2)
Au fost proiectati primeri pentru introducerea MeBPep bogată în Cys si His in celule. Ulterior myrGFP-MeBPep-(Cys/His/aminoacizi carboxilați – rich) a fost amplificat prin PCR. Ampliconilor obținuți în vectorul pGREG596, care datorită secvenței de miristoilare la capătul N-terminal al ADN-uli pentru GFP permite exprimarea pe fața interioară a membranei plasmatice, au fost clonati. Ampliconii purificați au fost incluși în vectorul pCRII prin procedeul TA cloning pentru subclonări ulterioare în vectori de interes. În parelel, ampliconii purificați au fost clivați cu restrictazele SpeI și SalI și introduși în pGREG595 (între situsurile SpeI și SalI, concomitent cu eliminarea fragmentului myGFP din vector. Prin acest procedeu se înlocuiește fragmentul myrGFP cu myrGFP-MeBSeq. Saccharomycs cerevisiae BY4741 a fost transformat cu constructele obținute, obținandu-se transformanți pentru toate plasmidele pozitive.
Act 2.3 – Cultura celulară a tulpinilor de drojdie care exprimă diverse GFP-MeBPep în medii sintetice care imită mediile obișnuite, care conțin concentrații scăzute, dar definite de metale esențiale. Caracterizare prin spectroscopia EPR. (din O2, partea 2), Act 2.4 – Cultura celulară a tulpinilor de drojdie care exprimă diverse GFP-MeBPep în medii sintetice care conțin concentrații mai mari decât cele normale, dar definite de metale esențiale. Caracterizare prin spectroscopia EPR (din O3, partea 2)
Culturile de culele By212 0, 4, 5, 22 si DE3, E9, D9, H9 au fost incubate in prezenta metalelor esențiale, in acest caz ioni de Cu2+ si Mn2+ variind timpul de expunere si concentrația.
Pentru a determina condițiile optime de creștere a linilor celulare folosite in prezenta ionilor de Cu2+ si/sau Mn2+ pentru a fi analizate prin metoda spectroscopica EPR concentrația de ioni demetale si timpii de incubare au fost variați. Au fost analizate diferite concentrații de Cu si/sau Mn la diferiti timpi de incubare. Timpii de incubare de 30 de minute si concentrati de Cu sub 1 mM s-au dovedit a cele mai favorabile pt spectroscopia EPR. In cazul ionilor de Mn nu a putut fi stabilita o limita superioara a concentratie de Mn asimilata de celule ei nefiind toxici, ca si cei de Cu, pt linile celulare folosite.
Act 2.5 – Dezvoltarea unui script MATLAB folosind rutina EasySpin pentru a simula spectrele EPR obținute (din O4, partea 1)
A fost dezvoltat un script Matlab pt simularea spectrelor EPR a ionilor de Cu2+ si Mn2+ pentru toate liniile celulare propuse. Prin simularea spectrelor EPR s-au putut determina cu o mai mare exactitate parametrii EPR a ionilor de metale folositi si mobilitatea acestora, stabilindu-se ca ei au fost incorporati in celule.
Activity reports
Publications
Decavanadate-Bearing Guanidine Derivatives Developed as Antimicrobial and Antitumor Species, International Journal of Molecular Sciences 2023, 24(24), 17137, Andreea Dumitrescu, Catalin Maxim, Mihaela Badea, Arpad Mihai Rostas, Alexandra Ciorîță, Alina Tirsoaga, Rodica Olar